情報科学研究科のネットジャーナルにインタビュー記事が掲載されていましたので、是非ご覧ください。

私たちは、非線形光学過程である多光子励起過程(図1)を用いた顕微鏡法(多光子顕微鏡、2光子顕微鏡、2光子励起レーザー顕微鏡)の生命科学への応用に取り組み、先導してきました。最近、私たちは生体”in vivo”2光子顕微鏡システムを構築することに成功し、光固有の高い空間分解能を損なうことなく、世界で最も深い生体組織中の断層蛍光イメージが取得できる方法論を完成させました(図2)。さらに、新しい光「べクトルビーム」を用いた「ナノイメージング」「超解像イメージング」を用いて、「生きた」生体分子複合体の構造と機能の関係を明らかにする新しい方法論を確立しようとしています。このように、私たちは、超短光パルスレーザー、遺伝子工学、電気生理学、光機能分子など、多岐にわたる科学技術を活用することで、生きた個体,生体組織での、「光によるインビボ(in vivo”)観察」「光によるインビボ(”in vivo”)操作」(オプトジェネティクス)を同時に実現する新しい生命機能のイメージング法を展開させることを目標としています。
 生命科学における私たちのミッションは、身体・臓器、細胞と生体分子との間といった階層性を持って、どうように生命維持に不可欠な機能が機能が創発されているのか、その原理を解明することにあると考えています。そのためには、実際に生命活動が行われている状態で、生体の機能が下部要素である生体分子や細胞群の時間的空間的な相互作用によってどのように実現されているかを探索していくことが極めて重要だと考えています。この考え方に基づいた研究から、シナプスや分泌腺細胞の分泌機能=開口放出・溶液輸送の分子機構について「逐次開口放出」(sequential compound exocytosis) (図5)など新しい概念を提出してきました。
 私たちの研究成果をさらに国民の健康と福祉へと還元するために、現在、臨床医療への応用も視野に入れた共同研究を他大学、研究所、企業等と実施しています。このような私たちの研究活動から、「光学」から「生命科学」までにわたり、そしてその「臨床応用」を目指す、新たな学際的な研究領域「光・細胞生物学」「光・脳科学」が誕生することを期待しています。

図1. 多光子励起法(2光子励起顕微鏡、多光子励起顕微鏡)の原理
多光子励起過程とは,フェムト秒の近赤外レーザーパルス光を対物レンズで集光することにより,1個の分子が同時に,複数個の光子を吸収し第一電子励起状態へ遷移する現象である(A)。多光子吸収は焦点でしか起きないので,焦点以外での無駄な吸収が無い上(B),深部到達性が高く,レーザーを走査することで断層像が取得できます。従って,生体臓器標本における分子・細胞機構を調べるのに最善の方法論である。多光子励起を用いた顕微鏡法(2光子顕微鏡)は,医・生物学に応用されてからまだ間がなく,その可能性の一部しかまだ使われていないことも魅力の一つです。今後,2光子顕微鏡はその高い定量性と空間解像によって,微小電極やパッチクランプ法と肩を並べる方法論になるでしょう。



① 最先端のレーザー顕微鏡の開発と脳科学・生理学への応用 

近赤外超短光パルスレーザーは非線形光学過程という特異な現象を引き起こします。私たちは、この過程を用いた顕微鏡法(多光子顕微鏡、2光子顕微鏡)を先導してきました。この多光子顕微鏡は生体内の組織の深部を高分解能で長期間観察が可能であるため、現在多くの分野で用いられてきています。生体深部の微細な細胞の形態や活動を「ありのまま」の状態で観察することを可能とします。特に最近、私たちが開発した “in vivo” 多光子顕微鏡は、麻酔下のマウス大脳新皮質において、世界最深部の海馬歯状回のニューロン観察に成功しました(Biomed. Opt. Express, 2015; Scientific Reprots, 2013)。さらに現在、この生体深部のイメージングに加え、光を用いて生体深部の細胞や分子の操作や刺激を可能とする手法の確立にも挑戦しています。この方法を用いて、脳の構造や機能の創発原理を解明しようとしています。さらに様々な生体組織や、臓器へ応用し、臨床、医療分野への展開を目指しています。特に、がん発症・転移、骨代謝異常の分子機構の解明につながることを期待しています。またアップコンバージョンなどの新しい光学現象を用いた顕微鏡や新規透徹剤の開発にも取り組んでいます(PLoS One, 2015)。

図2. 麻酔マウスの大脳皮質〜海馬歯状回のEYFP発現神経細胞群の3次元再構築
私たちが新たに開発した“in vivo” 2光子顕微鏡法は、マウス個体を生かしたまま「そのまま」の状態で、大脳表面からおよそ1.6mm程度までの深部の断層像を取得することに成功し、世界で最も優れたものの一つです。
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図3 マウス生体脳深部での神経線維の"in vivo" レーザーアブレーション
“in vivo” 2光子顕微鏡法の光学条件の最適化により、今までは不可能であった深部領域での、神経線維の"in vivo" 破談に成功しました。神経回路に応用することが期待されます。
名称未設定3図3. マウスの脳硬膜や皮膚の、SHG及び2光子励起による同時イメージング
非線形光学過程の一種である第二次高調波発生(SHG)を用いることで、生体内部の線維状の構造を可視化することが出来る。特に、線維状構造物を無染色で可視化することが可能である。

(a) H-lineマウスの脳硬膜(左:EYFPの2光子励起蛍光、中:SHG、右:オーバーレイ)

(b)マウス耳介の自家蛍光とSHGの同時観察(水色:SHG,ピンク:自家蛍光)


図4.マウス皮膚の3次元ライブイメージング
H2BEGFPヘアレスマウスの系を確立し、蛍光とSHGを用いてマウスの皮膚の3Dライブイメージングに成功しました(PLOS ONE, 2016)。その結果、斜め方向分裂と上皮の厚さの関係が明らかになりました。
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図5.補償光学
液晶素子を用いて、生体深部観察時に発生する収差を補償するデバイスの開発の成功しました。(J. BIomed. Opt., 2015; Proc. SPIE, 2015; J. BIomed. Opt., 2016;Proc. SPIE, 2016
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図6. 多点スキャン型2光子共焦点顕微鏡の高度化と応用

励起用レーザーの同時多点スキャンを用いることで、高速の生体イメージングが可能となってきました(Anal. Sci. , 2015)。また、植物細胞などに適した観察法であることも次第に明らかになってきています。
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② 「ベクトルビーム」による超解像顕微鏡、ナノイメージング

光の波動性による回折限界のため、光を用いたイメージングでは、300 nm程度が空間分解能の限界でした。この問題に私たちは、新しいレーザー光「ベクトルビーム」を用いて挑戦し、古典的な光の回折限界を超える高い分解能を実現しています(図4、5)。さらに現在、2光子顕微鏡とSTED顕微鏡を組み合わせた新しい超解像顕微鏡の開発に着手しました(Opt. Express, 2014)(図5)。今までは観察が不可能であった生きた細胞内での微小な構造や分子の動態を、電子顕微鏡に迫る空間分解能で観察することで、細胞や生体分子の構造と機能について解明することを目標としています。

図7. 光ニードルを用いた超解像顕微鏡

新しいレーザービーム「ベクトルビーム」を用いて、光の回折限界を超えたナノイメージングを実現する方法論を開発しています。(Microscopy 2013; Opt. Express, 2011


図8. 超解像顕微鏡ー「2光子STED顕微鏡」の開発
ベクトルビームの技術を応用し、透過型液晶デバイスにより【光渦】を発生させることが出来ます。これを用いた誘導放出抑制現象を発生させ、光の回折限界を超えたナノイメージングを実現する方法論を開発しています。(Opt. Express, 2014; 東北大・佐藤俊一教授、横山弘之教授との共同研究)

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③ 神経伝達機能や内・外分泌腺の分泌現象の分子機構と病理の研究

細胞が細胞外部に物質を放出する際には、分泌小胞と細胞膜の融合による開口放出という機構が用いられています。この分子機構は、神経伝達に重要な化学伝達物質や多様なホルモン、消化酵素、破骨細胞の骨を溶かす分泌液の放出など、全て共通です。この膜融合を担う生体分子機械の仕組みや、糖尿病や骨粗相症など、分泌機能の破綻による疾患発症の仕組みを明らかにすることを目指しています。さらに現在、破骨細胞における酸性小胞の輸送やグルコース輸送体を運ぶ小胞の運動の制御機構などを進めています。

図9. 「逐次開口放出」の発見
2光子顕微鏡を用いた開口放出の定量的測定法を確立しました。この方法論は,観察する平面内のすべての開口放出を検出し,融合細孔の動態をナノメーター(1-20nm)の解像で測定でき,また,すべての分泌臓器に適用可能です。この手法を用いることにより,小胞の動員が逐次的に細胞内に進む様式があることが明らかとなりました。この様式は様々な細胞,組織で確認されており,極めて一般性が高いものです。さらに開口放出に必要とされるSNARE分子の動態と機能の可視化解析を進めています。(Nature cell biology, 2001; Science 2003;JBC, 2004; EMBO J, 2006; J. Physiol., 2007;Am. J. Physiol., 2009; PLoSOne 2012, J. Cell Biol., 2016)。


図10. 新規Ca2+センサー「カメレオンナノ」を用いたCa2+依存性開口放出の可視化
最も感度の高いCa2+センターの一つである「カメレオンナノ」を用いることで、膵臓外分泌腺において開口放出を惹起するCa2+波動の可視化に成功しました。ほぼ全ての臓器に「カメレオンナノ」は発現しており、多様な臓器におけるCa2+シグナルの研究が加速されることが期待されます(基生研・野中茂紀先生、阪大・永井健治先生、愛媛大・今村健志先生との共同研究: Int. J. Mol. Sci, 2014

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図11. 新規蛍光タンパク質シリウスを用いた破骨細胞モデルにおける酸性小胞の可視化
新規蛍光タンパク質シリウスは最も短い蛍光波長を持つGFPの変異体のひとつですが、酸性環境下でも蛍光が減弱することが無いという性質を持っています。さらに2光子顕微鏡を用いると1波長励起で同時多重可視化が可能です(Nature Methods, 2009)。そこで私たちは骨代謝に不可欠な破骨細胞モデルの酸性小胞のSNARE分子をラベルし、その小胞輸送における分子機構を明らかにしようと試みています。(ピンク:シリウスタグ化VAMP、緑:酸性小胞)